在細胞培養中，顯微鏡是觀察細胞狀態、密度、形態、污染情況及判斷傳代或實驗時機的核心工具。由于觀察對象是活細胞、透明且附著在培養皿底，其操作技巧與觀察病理切片有很大不同。

以下是一些核心的操作技巧，主要針對倒置顯微鏡（*常用的細胞培養觀察工具）：

一、 觀察前的準備與原則

優先使用倒置顯微鏡：

培養瓶、培養皿的底部通常較薄（0.5-1mm），倒置顯微鏡的物鏡從下方觀察，可以直接看到貼壁細胞，無需將培養液倒掉或加蓋玻片，既無菌又保留細胞原本形態。

如果使用正置顯微鏡，必須用培養皿蓋或特制的培養皿，否則高倍物鏡可能會碰到液面。

保持無菌意識：

觀察前用75%酒精擦拭培養瓶/皿外壁（特別是瓶口和底部）。

如果需要在超凈臺外觀察（如放在桌面顯微鏡上），務必擰緊瓶蓋，防止污染。

盡量避免手直接觸碰鏡頭（手上有油脂和細菌）。

二、 核心觀察技巧（光路與調焦）

這是新手*容易出錯的地方，關鍵在于調整光的對比度，因為活細胞是透明的。

必須使用相差模式（Phase Contrast）：

將顯微鏡上的相差環（通常在載物臺下方聚光鏡處）轉到 “PH1” 或 “PH2” （對應10x或20x物鏡）。

如果顯微鏡沒有相差功能，可以縮小光圈（減小聚光鏡的孔徑光闌）來人為增加對比度，但圖像會變暗且分辨率下降。

原理：普通明場下，透明細胞與培養液幾乎無反差，只能看到輪廓。相差顯微鏡可以將光通過細胞時產生的相位差轉換為明暗差。 

操作： 

調焦技巧：先找“緣”，再找“底”： 

針對培養瓶：培養瓶底部有弧度。如果調焦一直模糊，說明你正在看液面氣泡或瓶身上層。

正確方法：先用低倍鏡（4x或10x），將旋鈕快速向遠調（升高物鏡或降低載物臺），直到視野中出現劃痕、灰塵或氣泡壁（這代表你調到了瓶底表面），然后再微調聚焦到細胞。

針對培養皿/孔板：底部是平的，直接聚焦到網格線或邊緣。一個實用技巧：先觀察培養皿邊緣的水滴凝結或標記筆痕跡，找到清晰的平面后，再移到視野中央。

判斷細胞健康狀況（重點）：

凋亡：細胞變圓、皺縮、漂浮、折光性消失（黑色透亮）。

細菌污染：背景中出現大量黑色小點（球菌）或細長桿狀物，并且這些黑點在高倍鏡下會快速運動（布朗運動或主動游動）。

支原體污染：細胞形態改變（如出現黑色細絲、細胞碎片增多），但肉眼很難看到支原體本身（需要DAPI染色或PCR檢測）。

好細胞：折光性強，輪廓清晰，有立體感，胞膜完整，核仁可見（如HeLa細胞貼壁呈梭形，核周有“暈”）。

差細胞/污染：

三、 觀察后的收尾與常見問題

油鏡使用的特殊要求：

在細胞培養中，盡量不要用油鏡。因為油會污染培養皿底部，且難以清除，導致后續觀察模糊。

如果必須看100x油鏡（如檢查細胞內顆粒），需將細胞培養在專用玻璃底培養皿上，且觀察后立即用無水乙醇擦凈。

避免熱漂移：

剛拿到手的培養皿（從培養箱取出）溫度較低（37℃），在室溫下鏡臺會迅速降溫。鏡頭和樣品溫差會導致圖像持續漂移。

對策：觀察前將培養皿在顯微鏡臺面上靜置1-2分鐘，讓其溫度穩定。

記錄與標記：

觀察時，建議在培養瓶上標記“傳代”、“加藥”、“拍照（固定）”等狀態。

對于多孔板，用馬克筆在板蓋和板底對應位置畫圈，鎖定你需要觀察的特定孔，避免反復移動找位置。

四、 進階技巧（提升效率）

使用低倍鏡快速掃描：

先用4x物鏡找到細胞貼壁生長的區域（通常是培養瓶的中央或一側），判斷鋪滿度（Confluency）。初學者常犯的錯誤是用10x或20x去看局部，導致誤判整體密度。

巧用培養皿的“記號”：

很多培養皿底部有網格或字母。用油性筆在網格交匯處標記位置，方便在加藥后快速找回同一視野進行時間點觀察。

數字成像技巧：

拍照時，關閉自動白平衡。因為細胞在相差模式下是灰白色背景，自動白平衡會讓細胞偏藍或偏黃。

如果照片背景偏亮（光暈），可以適當降低聚光鏡高度或微微傾斜培養皿（注意不要污染鏡頭）。

總結下來，*核心的三點：

用相差模式（PH），解決透明細胞看不見的問題。

調焦到瓶底劃痕/邊緣，避免對著液面空氣瞎調。 

觀察漂浮顆粒和背景黑點，快速判斷污染。

另外，如果在使用過程中發現什么細節不清楚，可以隨時問我。